干扰神经元活动是研究特定类群神经元及与之关联的环路---行为变化的重要方法。现阶段常用的方法是用不同的手段去兴奋或抑制神经元的活动。其中，抑制神经元的活动可以大体分为时间空间尺度分辨清晰的可逆的抑制以及在作用机制上的不可逆的沉默。不同的实验要求对神经元活动的抑制不同，本文简要介绍抑制神经元活动的常用方法。
1. 神经元沉默策略
图 1. 沉默神经元可以分为三个层次：可逆性，细胞特异性和时空精准性。方法包括局部冷却，药理学方法（受体拮抗剂、通道阻断剂）和遗传学手段（光遗传、化学遗传结合病毒工具）（Fig 1A）。在研究中，通常结合不同的方法互为补充，在各自的作用机制和适用范围内，提高对目的细胞的特异性操作（Fig 1B）[ Ref 1]。
2. 常用的遗传学工具
图 2. 神经元沉默的遗传学方法，可分为光驱动，配体驱动及组成型驱动三种模式（Fig 2）[ Ref 1]。
3. 细胞亚结构沉默
在特定的投射环路中，抑制神经元突触传递有助于阐明其在神经网络动态和动物行为中的作用。能够对选定区域的特定类群细胞的突触传递进行瞬时的抑制是较为理想的情况，但许多投射来自多个神经元群，汇聚在某个脑区，在空间上与其他长距离输入和局部轴突交织。药理学和光化学手段的干预，可以对特定脑区的特定的神经递质输入进行有效抑制，光遗传和化学遗传工具在细胞特异性和时空特异性上具有显著优势，在不影响上游细胞胞体和其他区域的旁侧轴突的同时抑制突触末端的功能。在某些情况下，时空特异沉默突触后单元（如树突棘和树突分枝）需要考虑特定神经元的输入。
4.沉默突触
突触水平沉默比胞体水平沉默更加复杂，主要包括以下几个原因： 1）将功能蛋白（视蛋白或化学遗传学工具）靶向到末端，需要蛋白的长期表达或者添加特定的功能域增强轴突运输；
2）相比胞体，对轴突的光遗传操作需要更高的激光功率；
3）轴突段的离子成分与胞体树突段不同，沉默工具的影响也难以预测；
4）记录突触前末端的活动比胞体更有难度。上述这些因素限制了对外部操作引起的突触前末端功能生理影响的评估，而这些影响常通过记录突触后的神经元或光学成像来间接判断。 目前对突触的沉默可以分为4类：
1）时空特异沉默突触前末端；2）化学遗传学手段沉默突触前末端；3）长期沉默突触前的功能；4）时空特异沉默突触后。
图 3. 光遗传和化学遗传学沉默亚细胞结构。在一个结构典型的神经元中，细胞内的氯离子浓度存在着差异，黑色表示浓度较低，红色表示较高（Fig 3A）；ACR（anion channelrhodopsins）激活，胞体和树突显著发生超极化，但在轴突中，因氯离子浓度的上升，可能发生去极化（Fig 3B）；Halorhodopsin，如eNpHR3.0和 Jaws在其离子泵功能激活之后可以将氯离子带入胞浆，形成均匀的轴突-树突梯度分布。尽管可以同时有效地沉默胞体和轴突的活动，由此产生的氯离子浓度上升也会造成GABA受体的去极化效应（Fig 3C）；质子泵rhodopsin使得神经元超极化，也可能会引起pH的显著变化和胞内Ca2+升高 ，在突触末端导致神经递质的自主释放（Fig 3D）；偶联Gi/o的脊椎动物rhodopsin通过招募GIRK通道抑制胞体树突区段，也有文献报道这类rhodopsin可能是直接作用于Ca2+ 通道而抑制神经递质的释放（Fig 3E）；偶联Gi/o的DREADDs经由招募GIRK通道抑制胞体树突部分，对突触传递的抑制可能并不依赖于GIRK，而是通过G蛋白介导的Ca2+通道活性的沉默发生的（Fig 3F）[ Ref 1]。
1）抑制性光遗传沉默：eArch3.0/eNpHR3.0
图 4. 光遗传抑制工具作用在突触前末端。eNpHR3.0抑制神经元的动作电位发放，而对神经元的自发发放无影响；eArch3.0在动作电位发放的同时显著增强神经元的自发发放，干扰净增长结果的计算；GtACR1对引发的释放无明显影响，而是直接刺激释放，不适于抑制实验（Top）[ Ref 2]。需要注意，ArchT3.0能够选择性并可逆性地沉默突触传递，不阻断动作电位，但其沉默过程由改变bouton pH值而非超极化介导（Bottom），实验中需要考虑pH改变带来的影响。
2）hM4Di化学遗传沉默
图 5. hM4Di介导突触沉默。受到配体扩散和生化通路作用时间约束，化学遗传学方法的时空特异性受限。在CNO作用下，突触后的电流被抑制，但突触前电位仍然存在。衍生的轴突定位的hM4Dnrxn(hM4D-neurexin，在hM4D的C末端引入neurexin-1α蛋白C末端的胞内结构域)，避免了胞体树突的超极化[ Ref 4]。
3）TeNT介导的不可逆性沉默
图 6. TeNT的作用方式。毒素在胞浆中特异性识别剪切囊泡运输和递质释放的相关蛋白，VAMP（synaptic vesicle protein synaptobrevin）是其重要的靶标。TeLC（tetanus toxin light chain）负责剪切蛋白，在目的神经元内选择性地消除突触囊泡胞吐，进而抑制神经递质释放。尽管缺少化学遗传学方法的精确性，TeNT在慢性沉默中以及当目的神经元主要只投射到一个下游区域时（由于神经侧枝也会因为TeLC的表达而沉默），可以非常高效。通常，这一方法利用Cre动物品系或神经特异性启动子驱动的Cre病毒，结合Cre依赖的病毒，如AAV-FLEX-TeLC实现细胞类群的选择性[ Ref 1, 5]。
小结
对神经活动的沉默是大脑结构，神经元类群功能鉴定和投射环路研究的重要方法。目前，采用光遗传和化学遗传工具干预神经活动已经取得了较多的发现和成果，但对沉默工具的选择和实验结果的解释，从概念到技术上还存在一些不足，对沉默策略的选用还需要谨慎对待。 References [1]. Neuron.Volume 95, Issue 3, p504–529, 2 August 2017. DOI: http://dx.doi.org/10.1016/j.neuron.2017.06.050 Silencing Neurons: Tools, Applications, and Experimental Constraints. [2]. Nat Neurosci. 2016 Apr;19(4):527-8. doi: 10.1038/nn.4270. How (not) to silence long-range projections with light. [3]. Cell Reprots. Volume 16, Issue 8, 23 August 2016, Pages 2259-2268 Archaerhodopsin Selectively and Reversibly Silences Synaptic Transmission through Altered pH. [4]. Neuron. 2014 May 21;82(4):797-808. doi: 10.1016/j.neuron.2014.04.008. Chemogenetic synaptic silencing of neural circuits localizes a hypothalamus→midbrain pathway for feeding behavior. [5]. Int J Mol Sci. 2012; 13(6): 6883–6901. doi:10.3390/ijms13066883 Fragment C of Tetanus Toxin: New Insights into Its Neuronal Signaling Pathway. 枢密科技提供一系列AAV/LV/RV载体的神经元/突触沉默工具：光抑制（eNpHR3.0/Arch/ArchT3.0）、化学遗传学（hM4Di）和神经元类群沉默（taCaspase 3/DTA）病毒工具。其他技术交流和产品使用，请联系我们。
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